מיסודות העבודה במקדש היה ארגון הכהנים למשמרות מסודרות. דוד המלך, יחד עם שני הכהנים הבכירים, עורך חלוקה מחדש של משפחות הכהונה כדי לקבוע את סדרי עבודתם. נציגי שתי משפחות הכהונה הגדולות המשתתפים בחלוקה הם וְצָדוֹק המייצג את בני אלעזר, וַאֲחִימֶלֶךְ המייצג את בני איתמר. הפרשנים מסבירים כי אחימלך זה הוא בנו של אביתר הכהן [רש"י, רלב"ג, מלבי"ם], אשר הודח ממשרתו באותה עת ולכן בנו ייצג את המשפחה [מלבי"ם]. דרך ייחוסו של אביתר, שהיה מבית עלי הכהן, אנו למדים שמשפחת עלי השתייכה לשושלת איתמר [רלב"ג]. באותה תקופה, בית איתמר הוא שהחזיק בכהונה הגדולה, ולכן מינויו של צדוק לכהן ראשי לצידו נחשב לחידוש יחסי [ביאור שטיינזלץ].
פעולת החלוקה, המבוטאת במילה וַיֶּחָלְקֵם (אשר מנוקדת באופן ייחודי אך משמעותה כצורת הפועל הרגילה של חלוקה [רד"ק, מנחת שי]), נבעה מצורך דמוגרפי. דוד ראה שנוצר פער מספרי בין המשפחות, כאשר בני אלעזר התרבו מאוד והיו רבים יותר מבני איתמר [רד"ק]. בשל כך, נקבעו עשרים וארבע משמרות כהונה בסך הכל: שש עשרה משמרות ניתנו לבני אלעזר, ושמונה משמרות לבני איתמר [רלב"ג, רד"ק].
באשר להתפתחות ההיסטורית של מספר המשמרות, מציגים הפרשנים שתי מסורות המבוססות על דברי חז"ל: דעה אחת גורסת כי משה רבנו תיקן במקור שמונה משמרות בלבד (ארבע לכל משפחה), שמואל הנביא הרחיב אותן לשש עשרה, ודוד העמידן על עשרים וארבע. לעומת זאת, דעה שנייה סבורה שמשה קבע מראש שש עשרה משמרות, ודוד ושמואל יחד הוסיפו והעמידו אותן על עשרים וארבע [רד"ק].
מטרת החלוקה הייתה לִפְקֻדָּתָם בַּעֲבֹדָתָם – כלומר, לארגן את הכהנים בהתאם למספרם ולעבודה המוטלת עליהם [מצודת דוד]. בפועל, סדר העבודה פעל במחזוריות קבועה: כל אחת מעשרים וארבע המשמרות שירתה במקדש במשך שבעה ימים. כדי להבטיח סדר מופתי יום ביום ללא תקלות, חולקה כל משמרת לשבעה "בתי אבות", כך שכל בית אב שירת יום אחד מוגדר בשבוע. כאשר סיימה המשמרת העשרים וארבע את שבוע עבודתה, חזר הסדר לתחילתו והמשמרת הראשונה שבה לשרת. שמות ראשי המשמרות שנקבעו בימי דוד נותרו על כנם, ובדורות הבאים המשיכו המשמרות להיקרא על שמם [רלב"ג].