תפקידי הלוויים במקדש מקיפים מגוון רחב של תחומי אחריות, החל משמירה פיזית ועד לסיוע פעיל בעבודת הקורבנות. אחריותם על משמרת אוהל מועד נועדה בראש ובראשונה להבטיח שאדם זר לא יתקרב למקום [מצודת דוד]. בנוסף, הם מופקדים על משמרת הקודש, הכוללת את השמירה על הדברים המקודשים, דוגמת כלי המקדש והקורבנות עצמם [מצודת דוד, ביאור שטיינזלץ].
חלק מרכזי מתפקידם מוגדר כמשמרת בני אהרן אחיהם, כלומר, אחריות לדאוג לכל צורכי הכהנים ולסייע להם לעבודת בית ה' [ביאור שטיינזלץ]. סיוע זה מתבטא בביצוע פעולות שונות הנדרשות לעבודה השוטפת, כגון הפשטת עורותיהן של עולות [מצודת דוד]. למעשה, הלוויים עוסקים בכל מלאכות תחזוקת המקדש ושמירתו שאינן מחייבות פעולת כהונה של ממש [ביאור שטיינזלץ].