קריאת ההתגלות הראשונה אל הנער מתרחשת באישון לילה, ומתאפיינת בקול מוחשי המעורר בלבול טבעי. הקול האלוהי שקרא לשמואל בשמו [ביאור שטיינזלץ] בקע מתוך קודש הקודשים שבהיכל ה'. אף שעלי הכהן שכב קרוב יותר אל הקודש פנימה, ואילו שמואל הלוי שכב בחוץ, הקול האלוהי דילג באורח פלא מעל עלי והגיע ישירות לאוזניו של שמואל [רש"י].
קול זה לא נשמע כהתגלות רוחנית מופשטת, אלא כקול אנושי ומוחשי לחלוטין [אברבנאל]. משום כך, שמואל מיהר להשיב הִנֵּנִי, כלומר, הנה אני [מצודת ציון], כביטוי לכך שהוא מוכן ומזומן [ביאור שטיינזלץ]. תשובתו המיידית בעודו במיטתו נבעה מסברתו כי עלי הוא זה שקורא לו, והוא קרא לעברו כדי להראות לו מיד כי אינו ישן [מלבי"ם].
כאשר שמואל קם ורץ אל עלי, הכהן הזקן לא העלה בדעתו שמדובר בנבואה. עלי סבר כי הנער מופעל מכוח הדמיון, וכי מתוך התרגשות פנימית נדמה היה לו ששמע קול חיצוני. תופעה זו, שבה תחושות פנימיות עזות מתפרשות בטעות כגירוי חושי חיצוני, אופיינית למצבי חולשה או סערת נפש, ולכן הניח עלי ששמואל רק דמיין את הקול והורה לו לשוב לישון [אברבנאל].