התורה מציבה גבולות ברורים בעולם הצומח, ואוסרת על יצירת תערובות חקלאיות בתוך כרם ענבים. איסור זה נושא בחובו השלכות חמורות, שכן הוא אוסר לחלוטין כל שימוש או הנאה מהיבול המעורב. פרשני המקרא רואים במצווה זו לא רק חוק חקלאי, אלא ביטוי לסדר האלוהי בטבע, שבו לכל מין נתנו כוחות ייחודיים מששת ימי בראשית, וערבובם משבש את חוקיות הבריאה [צרור המור, שפתי כהן, רבנו בחיי]. הקפדה על הפרדה זו מזכירה לאדם את נוכחות הבורא ואת חוקיו בעולם [רש"ר הירש]. במישור הסמלי, יש שראו בכך אזהרה מפני ערבוב של מצווה ועבירה יחד, כגון מתן צדקה במקביל לדיבור לשון הרע [חומת אנך].
האיסור המרכזי מתמקד במילים לֹא תִזְרַע כַּרְמְךָ כִּלְאָיִם. על פי הגישה המרכזית, המבוססת על דברי חז"ל, האיסור חל דווקא כאשר אדם זורע יחד חיטה, שעורה וחרצן של ענב בתנועת יד אחת [רש"י, מזרחי, רבנו בחיי, גור אריה, מלבי"ם, משכיל לדוד]. אף על פי שכבר קיים איסור כללי בתורה על זריעת כלאיים בשדה, התורה מוסיפה איסור מיוחד לכרם כדי ללמד שהעובר על כך לוקה פעמיים – פעם אחת על איסור כלאי שדה ופעם נוספת על כלאי כרם [מזרחי, רבנו בחיי, שפתי חכמים].
תוצאת ההפרה מנוסחת במילה פֶּן תִּקְדַּשׁ, אשר זכתה למספר פירושים. גישה אחת מסבירה את המילה מלשון טומאה, תיעוב וערבוב שלילי [רש"י, אבן עזרא, חזקוני, נתינה לגר, ביאור שטיינזלץ]. גישה שנייה מפרשת זאת מלשון הבדלה והפרשה; בדומה להקדש שאסור בשימוש חול, כך יבול זה נאסר לחלוטין בהנאה [רשב"ם, הטור הארוך, רלב"ג, הכתב והקבלה, ביאור יש"ר]. גישה שלישית דורשת את המילה כנוטריקון של "תוקד אש", כלומר, היבול האסור חייב להישרף כליל ואין להפיק ממנו כל תועלת [רבנו בחיי, תורה תמימה, שפתי כהן, פענח רזא].
הפסוק מפרט את המרכיבים שנאסרים: הַמְלֵאָה הַזֶּרַע אֲשֶׁר תִּזְרָע וּתְבוּאַת הַכָּרֶם. המילה הַמְלֵאָה מתייחסת לתוספת הגידול ולתבואה שכבר התמלאה בתוך השיבולת שלה [רש"י, העמק דבר, הכתב והקבלה]. המילים אֲשֶׁר תִּזְרָע מדגישות את יסוד הכוונה; האיסור חל רק כאשר הזריעה נעשתה במכוון. אם הזרעים הגיעו לכרם במקרה, למשל דרך מי השקיה, זבל, או שרוח העיפה אותם לשם ללא רצון הבעלים, הם אינם נאסרים [רלב"ג, הכתב והקבלה, תורה תמימה, מלבי"ם]. עם זאת, אם האדם ראה את הזרעים שצמחו במקרה והחליט לקיים ולטפח אותם, הם נאסרים [תורה תמימה, צפנת פענח].
המרכיב השלישי הוא וּתְבוּאַת הַכָּרֶם, שהם הענבים עצמם. הפרשנים מציינים כי האיסור אינו חל באופן מיידי, אלא תלוי בשלבי הגידול: הזרעים נאסרים רק משלב ההשרשה בקרקע, והענבים נאסרים רק משיגיעו לגודל של פול לבן או לשליש מגידולם [תורה תמימה, מלבי"ם, צפנת פענח]. בנוסף, המילה כַּרְמְךָ מלמדת שהאדם יכול לאסור רק את הכרם שלו, ואינו יכול לאסור כרם של אדם אחר על ידי זריעה בו ללא הסכמתו [הכתב והקבלה, תורה תמימה, רלב"ג]. לבסוף, בעוד שאיסור כלאי שדה חל מהתורה רק בארץ ישראל, חומרתו היתרה של איסור כלאי הכרם, האוסר את היבול בהנאה, הביאה את חז"ל להחילו גם מחוץ לארץ ישראל [רבנו בחיי, רש"ר הירש].