מעמדו של הכהן הגדול נושא בחובו אחריות כבדה לטהרת המשפחה, וכל חריגה מכללי הנישואין גוררת השלכות עמוקות על שושלתו. הפסוק מזהיר מפני פגיעה בקדושת הכהונה, שהיא מתנה ייחודית העוברת מדור לדור.
הביטוי וְלֹא יְחַלֵּל זַרְעוֹ קובע כי אם הכהן נושא אישה האסורה לו, הוולד הנולד מאותה מערכת יחסים מאבד את קדושת הכהונה ומקבל מעמד של "חלל" [רש"י, רמב"ן, גור אריה]. משמעות מעמד זה היא שהבנים הזכרים נחשבים כישראל לכל דבר: הם מותרים להיטמא למתים ולישא נשים הפסולות לכהונה, אך במקביל הם פסולים לעבודת המקדש ולאכילת תרומה [שפתי חכמים, תורה תמימה, רש"ר הירש, ביאור יש"ר]. עם זאת, הילד אינו נחשב לממזר, אלא רק מופקע ממעמד הכהונה [תורה תמימה].
בקרב הפרשנים קיימת מחלוקת לגבי מהותו של איסור זה. גישה אחת רואה בו המשך והסבר לפסוק הקודם: התורה אוסרת על הכהן לישא נשים מסוימות כדי שלא יביא לידי חילול זרעו [רש"י, הטור הארוך, גור אריה]. לעומת זאת, הגישה המרכזית בקרב רוב הפרשנים היא שמדובר במצוות לא תעשה נפרדת ועצמאית. לפיכך, כהן שמקדש אישה פסולה וגם בא עליה נענש במלקות כפולות על שני איסורים שונים, ואפילו קיום יחסי אישות ללא נישואין נחשב לעבירה על איסור זה [רמב"ן, מזרחי, תורה תמימה, העמק דבר, פירושי רד"צ הופמן]. יש המוסיפים כי איסור זה מתמקד באזהרה שלא לקחת נשים פסולות בסתר, בעוד הפסוק הקודם עסק בנישואין פומביים [אבן עזרא, חזקוני]. האיסור חל רק כאשר מעשה הביאה הושלם, ואפילו במקרה של אונס נוצר חילול [תורה תמימה].
החילול אינו פוגע רק בוולד. הפרשנים מסכימים כי גם האישה עצמה מתחללת ונפסלת מזכויות הכהונה כאכילת תרומה, מתוך קל וחומר: אם הזרע שלא חטא מתחלל, בוודאי שהאישה שעברה עבירה מתחללת [תורה תמימה, רלב"ג, מלבי"ם, בכור שור, אדרת אליהו]. באשר לכהן עצמו, הוא אינו הופך לחלל וקדושתו הבסיסית נותרת בעינה, אך הוא נפסל זמנית מעבודת המקדש עד שיגרש את אותה אישה [רש"ר הירש, העמק דבר, בכור שור].
המילה בְּעַמָּיו (אשר העי"ן שבה מנוקדת בפתח והמ"ם דגושה [מנחת שי]) נושאת משמעות כפולה. מבחינה ציבורית, היא דורשת מהכהן הגדול לשמש מופת ודוגמה אישית לטהרת המשפחה לעיני כל העם [פירושי רד"צ הופמן]. מבחינה הלכתית, המילה מדגישה שהחילול עובר לנצח אך ורק דרך קו הזכרים. בתו של חלל זכר תהיה פסולה לכהונה לעולם, אך אם אישה חללה נישאת לישראל כשר, בתה תהיה כשרה לכהונה, שכן ייחוס הכהונה נקבע על פי האב בלבד [תורה תמימה, מלבי"ם, רש"ר הירש, אדרת אליהו].
הפסוק נחתם בהכרזה כִּי אֲנִי ה' מְקַדְּשׁוֹ. ה' הוא שקידש את הכהן וייעד אותו לעבודתו, ולכן עליו להתרחק מזיווגים פחותים ולא להפקיר את כבודו [רלב"ג, פירושי רד"צ הופמן]. סיום זה מדגיש את ההבדל העמוק בין ישראל לכהן: אדם מישראל שחוטא באשת איסור פוגם אומנם בזרעו, אך מעמדם הלאומי נותר כישראל. לעומתו, הכהן, שניחן בקדושה יתרה מאת ה', עלול לאבד קדושה ייחודית זו ולהפקיע את זרעו מן הכהונה לעד [ביאור יש"ר, העמק דבר].