הציווי הראשון שניתן לאנושות מציב גבולות ברורים בתוך השפע הגדול של גן עדן. איסור האכילה מעץ הדעת אינו רק מגבלה תזונתית, אלא מבחן מהותי שנועד לעצב את אופיו של האדם, ללמדו משמעת עצמית ולהעמידו בניסיון של שליטה על יצריו [קאסוטו]. דרך ציווי זה, מתבררים מושגי יסוד של בחירה חופשית, שכר ועונש, וגבולות ההשגה האנושית.
הכתוב מדגיש לֹא תֹאכַל מִמֶּנּוּ. כפל המילה מִמֶּנּוּ נועד לחזק את האזהרה ולהוסיף ביאור. רוב הפרשנים מסכימים כי הכוונה היא לאיסור אכילה מפירות העץ, שכן עץ עצמו אינו דבר מאכל. עם זאת, יש המרחיבים את האיסור ורואים במילה זו אזהרה מפני כל הפקת תועלת והנאה מן העץ, אפילו על ידי נגיעה, משום שדבר זה עלול להוביל לאכילה עצמה [העמק דבר]. גישה לשונית אחרת מסבירה כי זוהי תופעה מוכרת בשפה המקראית לחזור על מילה כאשר המשפט מתארך [ר' סעדיה גאון], ויש המפרשים שהמילה באה להורות שהאיסור חל על האדם ועל כל התלויים בו [חזקוני].
שמו של האילן, עֵץ הַדַּעַת טוֹב וָרָע, מעורר שאלה מהותית לגבי מצבו השכלי של האדם לפני החטא. הפרשנים מסכימים כי האדם נברא חכם ובעל אינטליגנציה גבוהה ביותר, עובדה המוכחת מכך שהעניק שמות מדויקים לכל בעלי החיים בהתאם לטבעם הפנימי. הרי לא ייתכן שה׳ יצווה ויזהיר יצור חסר שכל והבנה [אבן עזרא, רד"ק, ר' סעדיה גאון, מחוקקי יהודה]. אם כן, העץ לא נועד להעניק חכמה בסיסית, שהרי אם היה מועיל לשכלו של האדם, ה׳ לא היה מונע אותו ממנו [ר' סעדיה גאון, תולדות יצחק].
הגישה המרכזית בקרב המפרשים היא שהעץ לא הוסיף חכמה עיונית, אלא עורר את יצר הרע, את תאוות המשגל ואת הבחירה הסובייקטיבית. לפני החטא, האדם פעל מתוך אמת מוחלטת ואובייקטיבית, בדומה לגרמי השמים, ללא פניות אישיות. אכילת הפרי הולידה בו את הרצון והתאווה, וגרמה לו לבחון את המציאות מתוך אינטרס אנוכי. כך, ה"טוב" הפך למה שרצוי ומושך, וה"רע" למה שאסור [רד"ק, תולדות יצחק, חומש קה"ת]. ה׳ ידע שהאדם עלול להיכשל, אך נתן לו את המצווה כדי להעמידו בניסיון שבו יוכל לכבוש את יצרו ולזכות בשכר רב, וכדי ללמדו שקיום מצוות ה׳ הוא מקור החיים [ביאור יש"ר, ר' סעדיה גאון]. לעומת זאת, עץ החיים לא נאסר עליו בתחילה, מאחר שכל עוד לא חטא לא נזקק לתרופת החיים. רק לאחר שחטא ודבק בו הרע, נמנעה ממנו הגישה לעץ החיים כדי שהרע לא יתקיים לנצח [תולדות יצחק, חומש קה"ת].
מעניין לציין כי הציווי ניתן לאדם כשהיה לבדו, לפני שחוה נבראה. הדבר נועד להעצים את היראה והכבוד שלה כלפיו כאשר יעביר לה את הציווי, להעניק לאדם שכר נוסף על הלימוד, ולשמש מודל לכל המצוות העתידיות שיועברו מראש המשפחה לביתו [ר' סעדיה גאון]. עובדה זו גם מספקת מעט סנגוריה לחוה, שלא שמעה את האיסור ישירות מפי הגבורה [ברכת אשר].
העונש על ההפרה מנוסח באופן נחרץ: כִּי בְּיוֹם אֲכׇלְךָ מִמֶּנּוּ מוֹת תָּמוּת. כפל המילים מעיד על חומרת הגזירה, אך מעורר קושי בולט, שהרי האדם לא מת ביום שאכל מן הפרי, אלא חי מאות שנים לאחר מכן.
הגישה המרכזית בקרב רוב הפרשנים היא שהמשמעות אינה מוות פיזי מיידי באותו היום, אלא שבאותו רגע האדם יהפוך ל"בן מוות" – כלומר, תיגזר עליו מיתה והוא יהיה נתון תחת שלטון המוות שיכה בו בבוא העת. לפני החטא, האדם היה אמור לחיות לנצח, שכן הנשמה האלוהית שבו העניקה לו קיום תמידי כשל מלאכי השרת. החטא קטע את הרצף הזה וקנס עליו מיתה [רמב"ן, טור הארוך, רבינו בחיי, רקנאטי, חזקוני].
מנגד, קיימת דעה הגורסת כי האדם, בהיותו יצור מורכב מיסודות חומריים, היה מיועד למות באופן טבעי מיום בריאתו. לפי תפיסה זו, משמעות העונש היא מיתה לא טבעית ומוקדמת – מעין עונש מוות בידי שמים לפני זמנו הקצוב [רמב"ן, שד"ל, רבינו בחיי, נתינה לגר]. יש המפרשים את כפל הלשון כרמז לשני סוגי המיתה הללו: הטבעית והמקרית [רבינו בחיי], או כתהליך הדרגתי של התמעטות הכוחות הפיזיים שמתחיל מיד עם האכילה [הכתב והקבלה].
גישה נוספת נשענת על התפיסה שיומו של ה׳ הוא אלף שנים. לפיכך, האדם אכן מת באותו "יום" אלוהי, שכן חי תשע מאות ושלושים שנה ולא השלים אלף שנות חיים [רד"ק, ריב"א, תולדות יצחק]. פירושים אחרים מציעים כי המוות המוזכר כאן הוא מוות רוחני המתבטא בניתוק ההשגה השכלית [רלב"ג], או שהגירוש מגן עדן מהווה מעין צורה מוקטנת של מוות [רש"ר הירש]. כמו כן, יש הטוענים כי חזרתו של האדם בתשובה היא שהמתיקה את הדין ומנעה את מותו המיידי [שד"ל, תולדות יצחק].
מעניין לבחון כיצד תפסו האדם וחוה את האזהרה. נראה כי הם הבינו את דברי ה׳ כפשוטם, וחשבו שפירות העץ מכילים חומר רעיל הקטלני בטבעו לכל מי שאוכל או אפילו נוגע בו. טעות זו בהבנת מהות העונש היא שאיפשרה לנחש להטעות את חוה, כאשר דחף אותה אל העץ והוכיח לה שהנגיעה בו אינה ממיתה, ומכאן הסיקה בטעות שגם האכילה אינה מסוכנת [ברטנורא, קונטרס חיבה יתירה].