ייעודו של שבט לוי לעבודת הקודש שלל ממנו נחלה קרקעית בארץ ישראל. תמורת עבודתם, הוענק להם המעשר הראשון מתבואת העם. עם זאת, קבלת המתנה מחייבת גם אותם בנתינה – עליהם להפריש תרומה מתוך המעשר שקיבלו ולהעבירה לכהנים, כהכרה בקדושת ה׳ ובמעמדו של הכהן.
המילים וְאֶל הַלְוִיִּם תְּדַבֵּר מעוררות דיון בקרב הפרשנים באשר לזהות מקבלי המעשר. הגישה המרכזית גורסת כי המעשר מיועד ללויים בלבד, שכן לכהנים יש מתנות משלהם. מנגד, יש הסבורים כי גם הכהנים נכללים בהגדרה זו וזכאים למעשר, גישה שקיבלה משנה תוקף מאוחר יותר כאשר עזרא הסופר קנס את הלויים והעביר את המעשרות לכהנים. הכפילות תְּדַבֵּר וְאָמַרְתָּ אֲלֵהֶם נושאת גם מסר חינוכי ומזהירה את הלויים לבל יתגאו במעמדם. העובדה שהם זוכים למתנות אינה הופכת אותם לשווים לאהרן הכהן; עליהם לזכור שבהקשר זה הם נחשבים כישראלים רגילים החייבים בהפרשת תרומה, ועליהם להכיר טובה לכהנים [שפתי כהן].
הצירוף מֵאֵת בְּנֵי יִשְׂרָאֵל מגדיר את מקור החיוב: ההפרשה חלה רק על תבואה של ישראל, ופוטרת תבואה שנלקחה מנוכרים. בנוסף, מילים אלו מלמדות שאין מוציאים מעשר ממי שכבר מוחזק בו כדין, ולכן כהן שקנה תבואה אינו מחויב לתת ממנה מעשר ללוי.
המילה בְּנַחֲלַתְכֶם מתפרשת כתמורה וכתחליף לנחלה הפיזית שהלויים לא קיבלו בארץ. יש מן הפרשנים המצביעים כאן על חישוב מדויק: אילו היו הלויים נוחלים בארץ, היה מגיע להם חלק אחד משנים עשר השבטים. קבלת עשירית מן התבואה הכללית, פחות האחוז הבודד שהם מפרישים לכהן, מותירה בידם שיעור השווה בדיוק לחלק שהיו אמורים לרשת [הכתב והקבלה]. יתרה מכך, ההשוואה לנחלה מלמדת על קביעות: כשם שנחלה אינה פוסקת, כך המעשר הראשון ניתן ללויים בכל שנה, אפילו בשנים שבהן חלוקת המעשרות משתנה וניתן מעשר לעניים, משום שזהו מקור פרנסתם היחיד.
הכתוב מורה וַהֲרֵמֹתֶם מִמֶּנּוּ, וטומן בחובו הלכות מעשיות. הפועל וַהֲרֵמֹתֶם (מלשון הרמה) מצביע על כך שההפרשה צריכה להיעשות רק מפירות תלושים ולא מתבואה המחוברת עדיין לקרקע. המילה מִמֶּנּוּ נדרשת על ידי רוב הפרשנים כ"ממינו" – כלומר, חובה להפריש מאותו המין בדיוק, ואין לתרום ממין אחד על מין אחר, או מתבואה חדשה על תבואה ישנה. בנוסף, מילה זו מלמדת שבדיעבד, גם אם ההפרשה נעשתה בצורה לא תקינה לכתחילה (כגון מפירות טמאים על טהורים), התרומה חלה.
לבסוף, השיעור הנדרש הוא מַעֲשֵׂר מִן הַמַּעֲשֵׂר, דהיינו עשירית מדויקת מתוך המעשר שקיבלו (שהיא אחוז אחד מהסך הכולל), המוגדרת כ"תרומת ה׳" בשל קדושתה. הפרשנים מציינים כי אם הלוי הקדים ולקח את חלקו בעוד התבואה בשיבולים, לפני שזו עברה תהליך של דישה המחייב את החקלאי להפריש תרומה גדולה לכהן, הלוי פטור מלהשלים את התרומה הגדולה, וחייב להעביר לכהן אך ורק את המעשר מן המעשר.