הציווי מופנה אל הלויים ומסדיר את חובתם להפריש תרומה לה' מתוך המעשרות שהם מקבלים. הכתוב מדגיש כי קבלת מתנות מחייבת נתינה והקדשה מתוך המובחר שבהן.
המילים מִכֹּל מַתְּנֹתֵיכֶם מתייחסות לכלל המתנות שהלויים מקבלים מבני ישראל [שטיינזלץ], ואף לתבואה שגדלה בשדות השייכים לערי הלויים, שכן גם שדות אלו ניתנו להם במתנה והם מחויבים להפריש מתנובתם [חזקוני, מלבי"ם]. החובה חלה גם על תבואה שהישראלי העניק ללוי מעבר לשורת הדין [העמק דבר]. בנוסף, המילה מִכֹּל מלמדת כי בדיעבד, אם אדם הפריש תרומה לפני שהפריש ביכורים, פעולתו תקפה [תורה תמימה].
הגישה המרכזית בקרב רוב הפרשנים מתמקדת במקרה הלכתי ייחודי הנגזר מהמילים תָּרִימוּ אֵת כָּל תְּרוּמַת ה'. בסדר ההפרשה הרגיל, הישראלי נותן תחילה "תרומה גדולה" לכהן, לאחר מכן "מעשר ראשון" ללוי, והלוי מפריש "תרומת מעשר" לכהן. אולם, הכתוב עוסק במצב שבו הלוי הקדים ולקח את המעשר שלו ישירות מערימת התבואה (הכרי) לאחר שנגמרה מלאכתה, ולפני שהישראלי הספיק להפריש ממנה את התרומה הגדולה לכהן. במקרה כזה, הלוי מחויב להפריש מתוך המעשר שקיבל גם את התרומה הגדולה (לרוב בשיעור של אחד מחמישים) וגם את תרומת המעשר. דין זה חל רק כאשר הלוי לקח את התבואה לאחר עיבודה; אך אם הקדים ולקח אותה בעודה שיבולים, הוא פטור ממתן תרומה גדולה ומחויב להפריש תרומת מעשר בלבד.
הדרישה להפריש מִכֹּל חֶלְבּוֹ משמעה שיש לתת מן החלק המובחר, היפה והנקי ביותר של היבול [אבן עזרא, חזקוני, רלב"ג, ביאור יש"ר, שטיינזלץ]. מכאן נלמדת ההלכה שאין לתרום מפירות רעים על פירות יפים [רש"ר הירש, תורה תמימה]. יתרה מכך, אם הישראלי נתן ללוי מעשר המורכב כולו מפירות משובחים, הלוי אינו יכול לטעון שהישראלי התכוון להיטיב רק עמו, אלא עליו להפריש את חלקו של הכהן מתוך אותו יבול מובחר [העמק דבר]. עם זאת, מילים אלו מתירות להפריש תרומת מעשר מפירות טהורים על פירות טמאים [תורה תמימה, מלבי"ם].
הביטוי אֶת מִקְדְּשׁוֹ מִמֶּנּוּ מתאר את החלק המקודש המצוי בתוך היבול, אשר אוסר את השימוש בו עד שיופרש [רלב"ג, ביאור יש"ר, שטיינזלץ, אבן עזרא]. המילה מִמֶּנּוּ מלמדת שתרומה גדולה חייבת להיות מופרשת מתוך תבואה הסמוכה פיזית זו לזו (מוקף), בניגוד לתרומת מעשר שניטלת גם שלא מן המוקף [תורה תמימה]. כמו כן, מילים אלו מהוות מקור לדיני תערובות: הן מלמדות על השיעור שבו תרומה מקדשת ואוסרת תבואת חולין (דימוע). אם חלק אחד של תרומה נופל למאה חלקים של תבואת חולין, התערובת כולה נאסרת לזרים, והתרומה בטלה ומותרת באכילה רק כאשר ישנם מאה ואחד חלקי חולין כנגדה [תורה תמימה, רש"ר הירש, מלבי"ם].