ברכתו של משה לשבט לוי מהווה נקודת מפנה היסטורית ורוחנית. השבט שספג בעבר את קללתו של יעקב אבינו על כעסו ועזותו, מתברך כעת בהנהגה הרוחנית של העם, לאחר שהוכיח כי השכיל לנתב את קנאותו לעבודת הבורא בנאמנות.
בפתיחת הפסוק וּלְלֵוִי אָמַר, רוב הפרשנים מסכימים כי משה אינו מדבר ישירות אל לוי, אלא מדבר על אודותיו ופונה בתפילה ישירה אל ה'. בניגוד לשבטים הקודמים שהוזכרו בגוף שלישי, כאן משה מעמיד את השבט לפניו פנים אל פנים [רמב"ן, הטור הארוך]. פרשנים רבים רואים בברכה זו מעין כפרה ותיקון לקללת יעקב; בעוד ששמעון, שותפו של לוי למעשה שכם, אינו נזכר כאן כלל בעקבות חטאיו, שבט לוי זכה לברכה משום שעמד בניסיון ולא נכשל בחטא העגל [כלי יקר, אור החיים, מלבי"ם, ריב"א].
לגבי המילים תֻּמֶּיךָ וְאוּרֶיךָ, הגישה המרכזית בקרב הפרשנים היא כי מדובר במערכת השמות הקדושים והנסתרים שבחושן המשפט, שבאמצעותם הועברה רוח הקודש והוראת הדרך לישראל. כלים אלו נמסרו לְאִישׁ חֲסִידֶךָ, הלא הוא אהרן הכהן ולזרעו אחריו [רש"י, ספורנו, רלב"ג, אברבנאל]. כמה פרשנים מפנים את תשומת הלב לסדר החריג של המילים, שכן לרוב מקדימה התורה את האורים לתומים. הקדמת התומים באה ללמד ששלמות המידות והתמימות המוסרית הן תנאי הכרחי שקודם להארה השכלית והרוחנית של האורים [רבנו בחיי, רש"ר הירש, שפתי כהן]. התואר "איש חסידך" מכוון בראש ובראשונה לאהרן, שזכה במעלה זו בזכות טוב לבו כששמח בגדולת אחיו הצעיר משה [אברבנאל], אך הוא מתייחס גם לכללות השבט שהתעלה לדרגת חסידות [העמק דבר, רש"ר הירש].
בהמשך מציין הפסוק אֲשֶׁר נִסִּיתוֹ בְּמַסָּה. משמעות המילה "מסה" היא ניסיון ובחינה. הפרשנים מסכימים כי ה' בחן את שבט לוי במספר ניסיונות במדבר, והם תמיד נמצאו שלמים ונאמנים. בניגוד לשאר העם, הלוויים לא נכשלו בתלונות, לא השתתפו בחטא המרגלים, ואף בחטא העגל פעלו לשם שמים בלבד [רמב"ן, אבן עזרא, ספורנו]. יש המפרשים כי המילה אינה רק לשון בחינה, אלא גם מלשון התרוממות ונשיאות, שכן דרך הניסיונות שבהם עמדו, הוכרה והתרוממה מעלתם הרמה [הכתב והקבלה].
בחלקו האחרון של הפסוק, תְּרִיבֵהוּ עַל מֵי מְרִיבָה, קיימת מחלוקת פרשנית מרתקת לגבי משמעות ה"ריב". גישה אחת גורסת כי ה' נהג עם אהרן במידת הדין ובדקדקנות יתרה ("נסתקפת לו לבא בעלילה"). אף על פי שמשה הוא זה שחטא בדיבורו כשאמר "שמעו נא המורים", אהרן נענש עמו. עונש מחמיר זה מעיד דווקא על חסידותו העצומה של אהרן, שכן זהו הפגם היחיד שנמצא בו, וגם בו הוא נכשל רק בעטיה של מריבת ישראל [רש"י, רמב"ן, ספורנו, תולדות יצחק]. ויש הרואים במילים אלו ביטוי לכאבו של משה, המתרעם בפני ה' על כך שאחיו אהרן נענש על לא עוול בכפו [שד"ל, בכור שור].
מנגד, יש המפרשים כי משמעות המילים היא שגם במי מריבה ה' בחן את לבו של אהרן ומצא אותו נאמן, שלם באמונתו ובלתי מהרהר אחר מידותיו של ה' [תרגום אונקלוס, רמב"ן, מזרחי, העמק דבר]. גישה שלישית וייחודית מסבירה כי המילה "תריבהו" אינה מתארת מריבה של ה' עם לוי, אלא להפך: הלוויים הם אלו שרבו ונלחמו את מלחמת ה' נגד החוטאים בישראל, כפי שעשו לאחר חטא העגל, ובזכות עמידתם האיתנה במריבה זו הם זכו לכהונה [הכתב והקבלה, אדרת אליהו].