מצוות "מעשר בהמה" המופיעה בפסוק זה מחייבת את האדם להפריש לה' עשירית מן הגידול הטבעי השנתי של עדריו. שורשיה של מצווה זו קדומים, וכבר יעקב אבינו נדר להפריש מעשר מבהמותיו [רד"צ הופמן]. מעבר למשמעות ההלכתית, למצווה זו ישנה מטרה חינוכית וחברתית רחבה: התורה כיוונה לכך שבעלי העדרים יעלו לירושלים מדי שנה כדי לאכול את המעשר. השהות בעיר, בה יושבת הסנהדרין ומרכז החכמה, נועדה לקרב את העם ללימוד תורה, כך שכל אדם יוכל לעסוק בחכמה או לתמוך בבניו הלומדים שם, וכך תמלא הארץ דעה [פרדס יוסף בשם ספר החינוך].
המצווה חלה באופן בלעדי על בָּקָר וָצֹאן, ואינה נוהגת בשאר סוגי הבהמות. הפרשנים מסכימים כי יש לעשר כל מין בנפרד: הבקר מתעשר לעצמו, והצאן (הכולל כבשים ועזים יחד) מתעשר לעצמו, ואין מעשרין מזה על זה. כמו כן, חובת המעשר חלה רק על בהמות שנולדו בעדרו של האדם באותה שנה. בהמות שנקנו, התקבלו במתנה, או כאלו השייכות לשותפים – פטורות מן המעשר, וכך גם בהמות בעלות מומים מולדים, יתומות, או כאלו שנולדו בניתוח קיסרי [רבנו בחיי, רלב"ג, הירש].
תהליך ההפרשה מתואר במילים כֹּל אֲשֶׁר־יַעֲבֹר תַּחַת הַשָּׁבֶט. השָּׁבֶט הוא מקל הרועים [אבן עזרא, שטיינזלץ]. הפעולה נעשית כך: כונסים את כל הולדות לתוך דיר בעל פתח צר המאפשר יציאה של בהמה אחת בלבד בכל פעם. רש"י מתאר כי הרועה "מוציאן" בפתח, אולם פרשנים אחרים [משכיל לדוד, הכתב והקבלה, תורה תמימה] מדייקים מתוך המילה יַעֲבֹר כי חובה שהבהמות יצאו ויעברו מעצמן, ולא שיוציאו אותן בידיים. כיצד עושים זאת? מעמידים את אימהותיהן מחוץ לדיר, והטלאים והעגלים יוצאים מעצמם החוצה לקול קריאתן. הרועה עומד בפתח, מונה אותם במקלו מאחת עד עשרה, וכאשר יוצאת הבהמה העשירית, הוא מסמן אותה בצבע אדום ("סיקרא") ומכריז עליה כמעשר.
התורה מדגישה כי דווקא הָעֲשִׂירִי הופך למעשר. קדושת המעשר חלה על הבהמה העשירית מאליה, מיד עם יציאתה, גם אם הרועה לא הכריז עליה במפורש [תורה תמימה, מלבי"ם]. עם זאת, התורה דורשת שהעשירי יהיה ודאי ולא ספק. לכן, אם התעורר ספק כלשהו במהלך הספירה – למשל, אם אחת הבהמות שכבר נספרו קפצה חזרה לתוך הדיר והתערבבה עם השאר – כל הבהמות שנותרו פטורות ממעשר, שכן כל אחת מהן היא כעת בספק [הכתב והקבלה, רלב"ג, הירש].
הלכה מעניינת הנובעת ממילה זו עוסקת במקרה של טעות בספירה. אם הרועה התבלבל וקרא לבהמה התשיעית "עשירי", לעשירית "תשיעי", ולאחת-עשרה "עשירי" – קדושת המעשר נתפסת בכולן, אך ברמות שונות: הבהמה התשיעית מקבלת קדושה אך אינה מוקרבת (אלא נאכלת לאחר שיפול בה מום), העשירית היא המעשר האמיתי, והאחת-עשרה מוקרבת כקורבן שלמים [חזקוני, מלבי"ם, הופמן].
בסיום התהליך, הבהמה הנבחרת יִהְיֶה־קֹּדֶשׁ לַיהֹוָה. קדושה זו מתבטאת בכך שדמה נזרק על המזבח וחלביה ("אימורים") מוקטרים לה'. אולם, בניגוד לרוב מתנות הכהונה, בשר מעשר הבהמה אינו ניתן לכהנים כלל, אלא נאכל כולו על ידי הבעלים בירושלים [רש"י, רבנו בחיי, הופמן]. בהמה זו ניחנת בקדושה חמורה: אסור למכור אותה, אסור לפדות אותה בכסף, ואם נפל בה מום – בעליה אוכלים אותה במומה, אך חל איסור מוחלט לגזוז את צמרה או להשתמש בה לעבודה [רבנו בחיי, תורה תמימה, הירש]. מדין תורה, מצוות מעשר בהמה נוהגת בכל מקום ובכל זמן, אך חכמים השעו את קיומה לאחר חורבן הבית, מחשש שאנשים יבואו בטעות לגזוז או לעבוד בבהמות הקדושות בהיעדר מקדש להקריבן [תורה תמימה].