הלויים מקבלים תפקיד כפול וייחודי במקדש, כשהם משמשים חוליה מקשרת, תפעולית ושומרת, בין הכהונה לבין האומה כולה. המילה מִשְׁמַרְתּוֹ מציינת באופן כללי כל תפקיד, מינוי או אחריות המוטלים על האדם לעשותם [רש"י]. עם זאת, ביחס לזהות בעל המשמרת בפסוק זה, קיימות גישות שונות.
גישה אחת מפרשת כי המילה מִשְׁמַרְתּוֹ מתייחסת לאהרן הכהן. לפי תפיסה זו, הלויים מצווים לפעול על פי ציוויו של אהרן [חזקוני], ולסייע לכהנים הן בשמירה פיזית על המשכן מפני כניסת זרים, והן בהכנה לוגיסטית של צורכי העבודה והקרבנות, כגון סולת, יין ושמן [העמק דבר, מלבי"ם, ברכת אשר על התורה]. מנגד, יש המפרשים כי המשמרת היא של מטה לוי עצמו, והכוונה היא לתפקידיהם הייעודיים של הלויים, כגון שירתם בעת הקרבת הקרבנות ונשיאת כלי המשכן [ברכת אשר על התורה].
לצד החובה כלפי הכהונה, הפסוק מטיל על הלויים גם את מִשְׁמֶרֶת כָּל הָעֵדָה. הלויים אינם רק משרתי הכהנים, אלא נציגיה ושליחיה של האומה כולה. המשכן והתורה שייכים לכלל ישראל, והלויים שומרים על נכס קדוש זה עבור העם, תוך שהם מגנים על הציבור מפני התקרבות בטעות למקום הקודש שעלולה להוביל לעונש [רש"ר הירש].
בפועל, ייצוג זה בא לידי ביטוי בכך שהלויים מבצעים את המוטל על הציבור לִפְנֵי אֹהֶל מוֹעֵד, ובפרט בכל הנוגע להבאת הקרבנות הציבוריים [אבן עזרא, העמק דבר, חזקוני]. יתרה מכך, תפקיד זה של דאגה לצורכי העבודה וניהול ענייני המקדש, היה ראוי מלכתחילה להיות מוטל על הסנהדרין, המייצגת את "כל העדה", אך בעקבות חטא העגל הועברה זכות זו ללויים [ספורנו, מלבי"ם].
מכאן שחתימת הפסוק, לַעֲבֹד אֶת עֲבֹדַת הַמִּשְׁכָּן, מלמדת ששמירת המשכן אינה שמירה צבאית רגילה, אלא נשיאה באחריות כוללת לצרכיו של המקום [ביאור שטיינזלץ], עבודה שאותה מבצעים הלויים בשמם של אהרן ושל כלל ישראל גם יחד [רש"ר הירש].