הציווי האלוהי מורה למשה להחליף בפועל את מעמדם של בכורי ישראל, שנועדו במקור לעבודת המשכן, ולהעביר את הזכות והחובה הזו אל הלוויים. הבכורות מופקעים מכל תפקיד פולחני ונותרת בהם קדושה מזערית בלבד שממנה יצטרכו להיפדות [ביאור שטיינזלץ]. המילים לִי אֲנִי ה' מבטאות כי מדובר בבחירה נצחית החתומה בחותם שמו של ה' [רש"ר הירש].
הפרשנים דנים באופייה של לקיחת הלוויים והחלפתם בבכורות. לקיחה זו לא הייתה פעולה מתמטית גרידא, אלא העברה רוחנית של קדושה. משה רבנו העמיד כל בכור יחד עם בן לוי, ובאמצעות אמירה מפורשת החליף את קדושת הבכורה והחילה על הלוי, שכן דברי קדושה דורשים ביטוי מפורש בשפתיים [העמק דבר].
תהליך ההחלפה יצר אתגר מעשי, שכן מספר הבכורות עלה על מספר הלוויים במאתיים שבעים ושלושה אנשים. כדי לקבוע ללא מחלוקות מי מבין הבכורות יזכה לפדיון על ידי לוי ומי ייאלץ לשלם חמישה שקלים, ערך משה גורל. הוא כתב פתקים בכתב ידו המוכר כדי למנוע זיופים, וכך כל בכור שהוציא פתק שעליו נכתב "לוי" נפדה, ואילו מי שהוציא פתק של "חמישה שקלים" חויב בתשלום [צאינה וראינה]. המניין עצמו נעשה על ידי מסירת שמותיהם של האנשים ולא על ידי ספירת גולגולות, מה שמנע את הסכנה הטמונה בספירת בני ישראל [מלבי"ם]. החלפה זו יצרה היקש הלכתי לדורות, הפוטר את הלוויים ואפילו את בניהן של נשים לוויות מכל דיני פדיון הבכור [תורה תמימה, רש"ר הירש].
חלקו השני של הציווי עוסק בבהמות: וְאֵת בֶּהֱמַת הַלְוִיִּם. הפרשנים מסכימים כי אין הכוונה לכלל הבהמות, אלא ספציפית לכבשי הלוויים שפדו את פטרי החמורים של בני ישראל. פדיון זה אינו חל על בכורות של בהמות טהורות, שכן בהמה טהורה קדושה מגופה ואינה בת פדיון כלל [אור החיים, מזרחי, ברכת אשר].
בשונה מפדיון בני האדם שדרש הקבלה מדויקת של אחד לאחד, פדיון הבהמות היה כללי יותר. שה אחד של לוי יכול היה לפטור מספר רב של פטרי חמורים של ישראלים, ולכן התורה לא מנתה את העודפים בבהמות כפי שמנתה בבני האדם [מזרחי, ברכת אשר].
לפדיון זה ישנו גם ממד רעיוני עמוק. החמור מסמל את הרכוש המיטלטל ואת הקניין החומרי. העובדה שהלוי פודה בשה שלו את חמורו של הישראלי, נועדה להעביר מסר ללוויים הנכנסים לעבודת הקודש: עליהם להקדיש לשירות ה' לא רק את אישיותם הרוחנית והמוסרית, אלא גם את כל אמצעי הקיום והרכוש החומרי שלהם [רש"ר הירש].