רגע השיא של עבודת יום הכיפורים מתרחש לפני ולפנים, בקודש הקודשים. מעשה הקטרת הקטורת נועד ליצור חיץ פיזי ורוחני המאפשר לכהן הגדול לעמוד במקום המקודש ביותר מבלי להיפגע. הקטורת אינה רק כעין קרבן, אלא היא משמשת כמסווה המסתיר את התגלות השכינה ושומר על חיי הכהן שניגש אל הקודש [שטיינזלץ].
הנחיית הכתוב וְנָתַן אֶת הַקְּטֹרֶת עַל הָאֵשׁ לִפְנֵי ה' מתייחסת לסדר הפעולות המדויק. הכהן מניח תחילה את מחתת הגחלים בין בדי הארון [ביאור יש"ר, רש"ר הירש], והוא נזהר שלא לשפוך את הגחלים על הקרקע, שכן התנהגות כזו נחשבת לפחיתות כבוד לפני מלך בשר ודם, וקל וחומר לפני מלך מלכי המלכים [משכיל לדוד]. רק לאחר מכן, בעודו עומד בפנים, הוא לוקח את הקטורת ונותן אותה על הגחלים.
הפרשנים מסכימים כי הדגש על מתן הקטורת עַל הָאֵשׁ שבתוך המחתה, ודווקא לִפְנֵי ה' בתוך קודש הקודשים, בא לשלול מכל וכל את גישת הצדוקים. הצדוקים טענו, מתוך תפיסה מוטעית של נימוס וכבוד, שיש להדליק את הקטורת מחוץ לפרוכת ולהיכנס כאשר היא כבר מעלה עשן. חז"ל והפרשנים דחו זאת בתוקף, והדגישו שההנחה וההבערה חייבות להיעשות רק בפנים. מחלוקת זו הייתה כה מהותית, עד שבימי בית שני היו משביעים את הכהן הגדול ערב יום הכיפורים שלא ישנה מדברי חכמים [מזרחי, תורה תמימה, שפתי חכמים, בכור שור]. למעשה, טעותם של הצדוקים חזרה על חטאם של נדב ואביהו, שהכניסו אל הקודש קטורת שכבר בערה באש זרה מתוך רצון סובייקטיבי, ולא פעלו מתוך ביטול מוחלט לרצון ה' [רש"ר הירש].
מטרת הפעולה היא וְכִסָּה עֲנַן הַקְּטֹרֶת. עשן הקטורת היה עולה כעמוד ישר עד לתקרה ומשם מתפשט וממלא את החלל [רש"ר הירש]. הענן נועד להחשיך את הבית וליצור מסך המונע מהכהן לזון את עיניו מהשכינה, שכן נאמר "כי לא יראני האדם וחי" [בכור שור, חזקוני, רד"צ הופמן]. כדי להבטיח ענן סמיך וראוי שיכסה את החלל, חובה היה לשלב בסממני הקטורת עשב מיוחד הנקרא "מעלה עשן" [מזרחי, תורה תמימה, רלב"ג].
הענן מכסה אֶת הַכַּפֹּרֶת אֲשֶׁר עַל הָעֵדוּת. המילה הַכַּפֹּרֶת נושאת משמעות כפולה: היא משמשת כמכסה פיזי לארון, וגם מסמלת את הכפרה על עם ישראל. הלוחות והתורה שבתוך הארון נקראים הָעֵדוּת משום שהם מעידים על הברית וכוללים את האזהרות למצוות ה' [הכתב והקבלה]. הציון המדויק שהכפורת נמצאת עַל הָעֵדוּת בא ללמד שלא היה שום כיסוי עץ או מפה שהפרידו בתוך הארון בין הכפורת לבין לוחות הברית [מלבי"ם, אדרת אליהו]. כמו כן, זכות התורה מסייעת לכהן הגדול לצאת בשלום מן הקודש [העמק דבר].
הכתוב מסיים באזהרה וְלֹא יָמֽוּת. אזהרה זו מלמדת שאם הכהן לא עשה את הקטורת כתיקונה, הוא חייב מיתה. פגם בקטורת יכול להיות חיסרון של אחד מסממניה, שינוי במשקלם, שכחה של עשב "מעלה עשן", או הקטרה של קטורת זרה [רש"י, שפתי חכמים, רלב"ג, אדרת אליהו]. עונש זה אינו נובע רק מעצם הכניסה לקודש הקודשים ללא צורך, אלא הוא עונש ספציפי וחמור על הקטרה פגומה [מזרחי, גור אריה].
ברובד הפנימי, הקטרת הקטורת בקודש הקודשים מסמלת את התגלות הנקודה העמוקה ביותר של הנפש האלוהית. ביום זה, הרוחניות גוברת על הגשמיות, וישראל מתעלים למדרגה של מלאכים שאינם זקוקים לאכילה ושתייה [חומש קה"ת]. הקטורת, העולה כולה לריח ניחוח, מבטאת את שאיפתה של האומה כולה להתאחד עם רצון ה' באופן מוחלט, ולהפוך למרכבה לשכינה בעולם [רש"ר הירש].