עבודת יום הכיפורים מגיעה בפסוק זה לשיאה, כאשר הכהן הגדול מטהר את המרחב המקודש ביותר מפני הפגמים הרוחניים שדבקו בו בעטיו של העם. פעולה זו נועדה להבטיח את המשך השראת השכינה במחנה ישראל, חרף חסרונותיהם.
המילים וְכִפֶּר עַל הַקֹּדֶשׁ מתייחסות לקודש הקודשים [אבן עזרא, רד"צ הופמן, ביאור שטיינזלץ]. הגישה המרכזית בקרב רוב הפרשנים היא שכפרה זו אינה מופנית ישירות אל האנשים שחטאו, אלא נועדה לטהר את המקדש עצמו מן הכתם הרוחני שדבק בו, כדי שקדושתו לא תושחת והשכינה לא תסתלק [שד"ל, העמק דבר, רש"ר הירש].
באשר למילים מִטֻּמְאֹת בְּנֵי יִשְׂרָאֵל, הפרשנים מסכימים כי הכתוב אינו מדבר על חטאים כלליים של העם (כגון עבודה זרה, גילוי עריות או שפיכות דמים), אלא מצמצם את הכפרה ל"טומאת מקדש וקדשיו" – כלומר, מקרים ספציפיים שבהם בני ישראל נכנסו למשכן או אכלו בשר קודש בעודם טמאים.
הכתוב מחלק את הפגיעות בקודש לשני סוגים: וּמִפִּשְׁעֵיהֶם מתייחס לחטאים שנעשו במזיד, מתוך מרד או כוונה תחילה, ואילו לְכָל חַטֹּאתָם מתייחס לעבירות שנעשו בשוגג [רש"י, מזרחי, רלב"ג]. רוב מוחלט של הפרשנים מצביעים על רובד הלכתי מדויק הטמון כאן: הכפרה על השוגג מיועדת למצב ספציפי שבו האדם ידע שהוא טמא, אך שכח זאת ונכנס למקדש (מצב המכונה "יש ידיעה בתחילה ואין ידיעה בסוף"). מכיוון שהאדם אינו מודע כעת לחטאו, הוא אינו יכול להביא קורבן אישי על שגגתו. לכן, פעולת הכהן הגדול ביום הכיפורים "תולה" ומגינה עליו מפני ייסורים, עד שייזכר בחטאו ויוכל להביא קורבן בעצמו [תורה תמימה, שפתי חכמים, משכיל לדוד, אדרת אליהו]. אף שההיגיון נותן שאם ה׳ מכפר על חטאים חמורים שנעשו במזיד, קל וחומר שיכפר על שגגות, הכתוב מציין את שניהם כדי ללמד שגם חטא שנעשה בשוגג דורש כפרה והגנה [ברכת אשר].
לאחר טיהור קודש הקודשים, התורה מצווה וְכֵן יַעֲשֶׂה לְאֹהֶל מוֹעֵד. כשם שהכהן הגדול הִזה את דם הפר והשעיר בין בדי הארון בפנים (הזאה אחת כלפי מעלה ושבע כלפי מטה), כך עליו לצאת אל ההיכל ולהזות את הדמים באותו אופן בדיוק על הפרוכת מבחוץ [רש"י, מלבי"ם, ביאור שטיינזלץ]. פעולה כפולה זו מסמלת תהליך של יציאה מן האידיאל הרוחני המוחלט של קודש הקודשים, אל עבר יישומו המעשי בחיי העם, המיוצג בהיכל [רש"ר הירש].
סיומו של הפסוק, הַשֹּׁכֵן אִתָּם בְּתוֹךְ טֻמְאֹתָם, מציג תפיסה תיאולוגית עמוקה ומנחמת: גם כאשר בני ישראל שקועים בטומאה, נוכחות ה׳ אינה נוטשת אותם [רש"י, רבנו בחיי, תורה תמימה]. הטומאה פוגעת בחוטאים עצמם, אך אינה יכולה לפגוע בשכינה [משכיל לדוד]. עם זאת, בעוד שה׳ מוכן לשכון בתוך טומאתם של ישראל ולסלוח על חטאיהם, הוא אינו יכול לדור בכפיפה אחת עם מי שנגוע בחטא הגאווה [פרדס יוסף].
יש מן הפרשנים שמוצאים בפסוק רבדים נוספים: המושג "קודש" יכול לרמז גם לאדם הצדיק ותלמיד החכם, שחי בתוך דור חוטא. הצדיק עלול להיפגע ולהיטמא מן האווירה הרוחנית הירודה שסביבו, וביום הכיפורים מתבצעת כפרה גם על פגם זה שנגרם לו בעל כורחו [חתם סופר]. במישור ההיסטורי, יש הרואים בהזאות אלו כפרה שורשית: דם הפר מכפר על חטא העגל, ודם השעיר מכפר על מכירת יוסף – חטאים המלווים את העם לדורותיו, ובכל זאת ה׳ שוכן בתוכם [שפתי כהן]. לבסוף, קדושת אוהל מועד, המייצגת את לימוד התורה, היא זו שמשמרת את השראת השכינה בעם ישראל לעד, שכן דברי תורה אינם מקבלים טומאה, ובכוחם להגן על העם להילחם את מלחמותיו גם בשעותיו הקשות [העמק דבר].