קדושתו של יום הכיפורים ואיסורי המלאכה שבו חורגים מגבולות הזמן והמקום, ועומדים בתוקפם גם בהיעדר עבודת המקדש. הציווי המוחלט על שביתה ממלאכה ביום זה מקיף את היממה כולה, ומהווה נדבך מרכזי בכפרת העוונות של עם ישראל לאורך כל הדורות.
הקביעה כׇּל־מְלָאכָ֖ה לֹ֣א תַעֲשׂ֑וּ מעוררת את תשומת לב הפרשנים, שכן איסור המלאכה כבר הוזכר בפסוקים הקודמים. גישה אחת מסבירה כי בניגוד לשאר המועדים שבהם נאסרה רק "מלאכת עבודה" כדי להתיר מלאכות של הכנת אוכל והוצאה מרשות לרשות, כאן נאסרה כׇּל־מְלָאכָ֖ה. מאחר שביום הכיפורים חל איסור אכילה ושתייה, היה מקום לחשוב שמלאכות כדוגמת הוצאה והבערת אש יהיו מותרות בו, ולכן הכתוב מדגיש שביום זה אסורה כל מלאכה לחלוטין, בדומה לשבת [ביאור יש"ר].
הגישה המרכזית בקרב רוב הפרשנים היא שהחזרה על איסור המלאכה נועדה להרחיב את זמן האיסור גם לשעות הלילה. בפסוקים הקודמים הופיע הביטוי "בעצם היום הזה", ביטוי שעלול היה להתפרש כהגבלה של איסור המלאכה ועונש הכרת לשעות היום בלבד בהן מאירה השמש, או רק לעיצומו של היום ללא התוספת שמוסיפים מן החול על הקודש. משום כך, באה אזהרה זו כדי להשוות את חומרת מלאכת הלילה למלאכת היום [רש"י, מזרחי, תורה תמימה, שפתי חכמים, גור אריה, דברי דוד, ברכת אשר על התורה]. בנוסף, הכפילות נועדה להרבות את מספר האיסורים שעובר מי שמחלל את היום [רש"י], או כדי להסמיך את איסור המלאכה להכרזה כי חוק זה הוא נצחי [אבן עזרא, חזקוני]. דעה נוספת גורסת כי היתירות בפסוק באה ללמד על איסורים ספציפיים, כגון איסור חיתוך והכנת ירקות כאשר יום הכיפורים חל בשבת [העמק דבר].
המשך הכתוב, חֻקַּ֤ת עוֹלָם֙ לְדֹרֹ֣תֵיכֶ֔ם בְּכֹ֖ל מֹשְׁבֹֽתֵיכֶֽם, מבסס את תוקפו הנצחי והמוחלט של יום הכיפורים, ללא תלות במקום או בזמן [רש"ר הירש]. המילה דור נגזרת מהמושג דירה, ללמד שהחוק תקף כל זמן שבו בני אדם דרים בעולם [אם למקרא].
הדגשה זו של בְּכֹ֖ל מֹשְׁבֹֽתֵיכֶֽם נושאת משמעות עמוקה במיוחד לתקופת הגלות. ניתן היה לחשוב שבהיעדר בית המקדש, מזבח, כוהן גדול ושעיר המשתלח, לא תיתכן כפרת עוונות. לכן התורה מדגישה שגם במושבות ישראל בגלות, כאשר חסר סדר העבודה המקורי, עצם השביתה המוחלטת ממלאכה והעינוי פועלים את פעולתם. שביתת הגוף מאכילה וממלאכה מושכת את קדושת היום ומביאה לכפרה שלמה, ובכך היא מהווה תחליף רוחני מלא לעבודת הקורבנות שפסקה [ספורנו, תורה תמימה, אלשיך].